Investigation of Tritrichomonas foetus in cryopreserved bovine semen by culture and polymerase chain reaction / Pesquisa por Tritrichomonas foetus em sêmen bovino criopreservado mediante isolamento e reação em cadeia da polimerase

Bovine Trichomoniasis (BT) is an infectious disease caused by Tritrichomonas foetus that can be transmitted either sexually or by fomites. In males, the disease is asymptomatic and permanent. T. foetus has been detected in semen samples where it is able to remain viable even when frozen. The objective of this study was to investigate the presence of T. foetus in 27 samples of commercial frozen bovine semen by culture and Polymerase Chain Reaction (PCR). Samples were thawed in water at 37°C. Part of the samples was inoculated in a test tube containing Diamond's medium and incubated at 35°C. Growth was evaluated every 24 hours via direct examination under a microscope. The other part was placed in an Eppendorf tube and frozen for later molecular analysis. After 10 days of culture, all samples were negative for T. foetus. The Quick-DNA Miniprep Kit (Zymo Research) without proteinase K was used for DNA extraction. The primers used in PCR were TRF3 and TRF4. PCR results were negative for all samples. In conclusion, bovine semen samples were negative for T. foetus in both diagnostic methods, according to the adopted methodology.(AU)

A tricomonose genital bovina (TGB), uma doença infectocontagiosa causada pelo Tritrichomonas foetus, é transmitida por via venérea e fômites contaminados. Em machos a doença é assintomática e permanente. O agente já foi encontrado em amostras de sêmen e é capaz de permanecer viável quando congelado. Este trabalho teve por objetivo investigar a presença de T. foetus em 27 amostras de sêmen bovino comercial congelado, por meio de cultivo e reação em cadeia da polimerase (PCR). As amostras foram descongeladas em água a 37ºC; parte foi inoculada em tubo de ensaio contendo meio Diamond, incubada a 35ºC com consequente avaliação de crescimento e avaliada a cada 24 horas, via exame direto em microscópio, e a outra parte foi diluída em PBS para análise molecular. Após 10 dias de cultivo, todas as amostras foram negativas. Para a detecção molecular foi utilizado o kit Quick-DNA Miniprep (Zymo Research) sem proteinase K para extração do DNA. Os iniciadores utilizados na PCR foram TRF3 e TRF4. O resultado da PCR foi negativo para todas as amostras. Conclui-se que as amostras utilizadas foram realmente negativas para a presença do patógeno em ambos os métodos diagnósticos, o que comprovou a inocuidade do sêmen testado.(AU)

What is known about Tritrichomonas foetus infection in cats? / O que sabemos sobre a infecção por Tritrichomonas foetus em gatos?

Abstract Tritrichomonas foetus is a parasite that has been definitively identified as an agent of trichomonosis, a disease characterized by chronic diarrhea. T. foetus colonizes portions of the feline large intestine, and manifests as chronic and recurrent diarrhea with mucus and fresh blood, which is often unresponsive to common drugs. Diagnosis of a trichomonad infection is made by either the demonstration of the trophozoite on a direct fecal smear, fecal culture and subsequent microscopic examination of the parasite, or extraction of DNA in feces and amplification by the use of molecular tools. T. foetus is commonly misidentified as other flagellate protozoa such as Giardia duodenalis and Pentatrichomonas hominis. Without proper treatment, the diarrhea may resolve spontaneously in months to years, but cats can remain carriers of the parasite. This paper intends to serve as a source of information for investigators and veterinarians, reviewing the most important aspects of feline trichomonosis, such as trichomonad history, biology, clinical manifestations, pathogenesis, world distribution, risk factors, diagnosis, and treatment.

Resumo Tritrichomonas foetus é um parasito que foi identificado definitivamente como agente de tricomoníase, caracterizada por diarreia crônica. T. foetus coloniza porções do intestino grosso dos felinos e se manifesta como uma diarreia crônica e recorrente, com muco e sangue, geralmente irresponsiva às drogas comumente usadas no tratamento. O diagnóstico da infecção por tricomonadídeos é feito pela demonstração de trofozoítos no exame direto de fezes frescas, cultura fecal e subsequente exame microscópico ou extração do DNA do parasito na amostra fecal e amplificação, utilizando-se técnicas moleculares. T. foetus é comumente confundido com outros protozoários flagelados, como Giardia duodenalis e Pentatrichomonas hominis. Sem tratamento adequado, a diarreia pode cessar espontaneamente em meses ou anos, porém os gatos podem permanecer portadores do parasito. Esse artigo pretende servir como fonte de informação para pesquisadores e veterinários, revisando os mais importantes aspectos da tricomoníase felina, como histórico, biologia, manifestações clínicas, patogênese, distribuição mundial, fatores de risco, diagnóstico e tratamento.

Detection of natural occurrence of Tritrichomonas foetus in cats in Araçatuba, São Paulo, Brazil / Detecção da ocorrência natural de Tritrichomonas foetus em gatos em Araçatuba, São Paulo

The aim of this study was to investigate the occurrence of Tritrichomonas foetus in cats in the area surrounding the city of Araçatuba municipality, State of São Paulo, Brazil. Fecal samples from 129 cats were collected by rectal flush technique. It was compared two diagnosis methods, direct examination of feces and PCR. The presence of T. foetus DNA was verified using PCR by amplification of 347-bp fragment from the primers TFR3 and TFR4 and amplicons of positive cases were sequenced. Statistical analyses were performed investigating the associations between T. foetus infection with gender, age, breed, presence of diarrhea and/or history of diarrhea, previous treatment, lifestyle, origin, environment, and co-infection. T. foetus was observed in one sample (n=129) by direct microscopic examination of feces while PCR was positive in five samples (3.9%). Giardia species and Cryptosporidium species co-infection was also observed. Statistical analyses showed no significant associations between T. foetus infection and all listed factors, although most positive cats were asymptomatic and lived in multi-cat household. The isolates of T. foetus showed 100% identical sequences with other T. foetus isolates from cats around the world. So, the occurrence of T. foetus was confirmed in cats in Araçatuba city (Brazil). This parasite must be considered as a differential diagnosis in cats with diarrhea and also in asymptomatic carriers as source of infection in multi-cat environments.(AU)

O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência de Tritrichomonas foetus em gatos na região do município de Araçatuba, SP, Brasil. Foram coletadas amostras fecais de 129 gatos através da técnica de lavado retal. Dois métodos diagnósticos foram comparados, o exame direto das fezes e a PCR. A presença de DNA de T. foetus foi verificada por meio da PCR através da amplificação de 347 pares de bases a partir dos iniciadores específicos TFR3 e TFR4. Posteriormente, os resultados amplificados das amostras positivas foram sequenciadas. Também foi feita análise estatística a fim de investigar a correlação entre infecção por T. foetus e sexo, idade, raça, presença e/ou histórico de diarreia, tratamento prévio, coinfecção, estilo de vida, origem e tipo de ambiente. O protozoário pôde ser observado em uma amostra através do exame direto das fezes e à PCR foram detectadas cinco amostras positivas (3.9%). Foram detectadas coinfecções por Giardia spp. e Cryptosporidium spp. Não foram observadas correlações entre infecção por T. foetus e todos os fatores listados anteriormente, embora a maioria dos felinos positivos fossem assintomáticos e vivessem em ambientes multigatos. O resultado do sequenciamento genético dos isolados das amostras positivas mostrou 100% de similaridade com outros isolados de felinos no mundo. Assim, a ocorrência de T. foetus foi confirmada em gatos em Araçatuba, São Paulo, Brasil. Sendo assim, o parasito deve considerado como diagnóstico diferencial em gatos com diarreia assim como em portadores assintomáticos como fontes de infecção em ambientes multigatos.(AU)

Co-infection by Tritrichomonas foetus and Pentatrichomonas hominis in asymptomatic cats / Co-infecção por Tritrichomonas foetus e Pentatrichomonas hominis em gatos assintomáticos

Tritrichomonas foetus, a parasite well known for its significance as a venereally transmitted pathogen in cattle, has been identified as a cause of chronic large bowel diarrhea in domestic cats in many countries of the world. In Brazil, several studies on the diagnosis of bovine trichomoniasis have been performed, but until now, no study was made regarding feline trichomoniasis. Thus, this is the first study to report the occurrence of T. foetus and Pentatrichomonas hominis in cats using morphological and molecular analysis. Feces from 77 cats were examined, four of which (5.2%) were positive for the presence of parabasalids. Morphological analysis of stained smears revealed piriform trophozoites showing the three anterior flagella, elongated nucleus and axostyle ending abruptly in fillet, characteristic of T. foetus. In scanning and transmission electron microscopy, identification characters similar to those previously reported for T. foetus were observed. The cultures containing trophozoites were submitted for molecular analysis, which resulted positive for T. foetus DNA using specific primers (TFR3 and TFR4), and all samples were positive and subjected to sequencing in which they showed 99.7-100% similarity with another isolate sequencing of T. foetus (JX960422). Although no trophozoite with consistent morphology of P. hominis has been visualized in the samples, differential diagnosis was performed using specific primers for P. hominis (TH3 and TH5) amplicon. In three of the four samples (3.89%) sequencing revealed 100% similarity when compared with another sequence of P. hominis deposited in Genbank (KC623939). Therefore, the present study revealed through the diagnostic techniques employed the simultaneous infection by T. foetus and P. hominis in the feces of cats. However, it was necessary to use more than one technique for the diagnosis of the co-infection...

Tritrichomonas foetus, um parasito bem conhecido por seu significado como um agente patogênico transmitido venereamente em bovinos, também foi identificado como causa de diarreia crónica do intestino grosso em gatos domésticos em muitos países. No Brasil, vários estudos sobre o diagnóstico de tricomonose bovina foram realizados, mas até agora, não há informação disponível em relação à trichomonose felina. Assim, este é o primeiro estudo a relatar a ocorrência de T. foetus e Pentatrichomonas hominis em gatos por meio de análise morfológica e molecular. Fezes de 77 gatos foram examinadas, a partir da qual quatro (5,2%) foram positivas para a presença de parabasalídeos. A análise morfológica de esfregaços corados revelou trophozoitos piriformes com três flagelos anteriores, núcleo alongado e axóstilo cuja projeção termina abruptamente em formato de filete, características estas de identificação morfológica T. foetus. Além disso, microscopia eletrônica de varredura e transmissão, revelaram caracteres morfológicos semelhantes aos descritos na literatura para esta espécie. A análise molecular de culturas utilizando iniciadores específicos para trofozoítos de T. foetus (TFR3 e TFR4), mostrou que as quatro amostras foram positivas para este parasito e osequenciamento dos fragmentos amplificados demonstraram 99,7-100% de similaridade com seqüências depositadas no GeneBank de T. foetus. Nenhum trofozoíto com morfologia consistente com a descrição de P. hominis foi visualizado nas amostras. No entanto, a análise molecular, utilizando iniciadores específicos para esta espécie (TH3 e TH5) detectou que três das quatro amostras (75%) também foram positivas para P. hominis e o sequenciamento de nucleotideos revelou 100% de similaridade dos amplicons quando comparada com o mesmo fragmento de DNA de P. hominis depositado no GenBank. Como tal, o presente estudo relata a coinfecção de gatos com T. foetus e P. hominis e destacou a exigência de uma combinação de métodos...

Determination of presence of Tritrichomonas foetus in uterine lavages from cows with reproductive problems / Determinação da presença de Tritrichomonas foetus em lavados uterinos de vacas com problemas reprodutivos

The aim of this study was to determine the presence of Tritrichomonasfoetus in two dairy herds on the Altiplano Cundiboyacense. Twenty-one low-volume uterine lavages from cows with a history of reproductive problems in two dairy herds located in the municipality of Sibaté (Cundinamarca) and Ventaquemada (Boyacá) were evaluated. In the first herd, 10 cows were sampled and in the second, 11 cows, based on three inclusion criteria. The uterine lavages were obtained through infusion of physiological saline solution into the uterine body. The samples were centrifuged and seeded in Tritrichomonas basal medium for 10-15 days at 37 ºC. The protozoa were evaluated on the day of sampling and 10 and 15 days after incubation by means of direct viewing under a dark-field microscope. Positive samples were stained with Wright and Lugol to identify the morphological characteristics. This study showed that T. foetus was present in 61.8% of the animals sampled. The determination that T. foetus was present in 61.8% of the samples analyzed is a significant finding given that in the herds evaluated, this agent had not previously been diagnosed.

O objetivo do presente estudo, foi determinar a presença de Tritrichomonas foetus em dois rebanhos leiteiros no Altiplano Cundiboyacense. De vacas com um histórico de problemas reprodutivos, foram avaliados 21 lavados uterinos de pequeno volume, em dois rebanhos leiteiros localizados nos municípios de Sibaté (Cundinamarca) e Ventaquemada (Boyacá). No primeiro rebanho, 10 vacas foram amostradas e no segundo 11, baseado em três critérios de inclusão. Os lavados uterinos foram obtidos mediante infusão de solução salina fisiológica no corpo do útero. As amostras foram centrifugadas e semeadas em meio de cultura básico para Tritrichomonas por 10-15 dias a 37 ºC. Os protozoários foram avaliados no dia da colheita de amostras e 10 e 15 dias após incubação por meio de visualização direta sob um microscópio de campo escuro. As amostras positivas foram coradas com Wright e Lugol para identificar as características morfológicas. Este estudo mostrou que T. foetus estava presente em 61,8% dos animais amostrados. A determinação de que T. foetus estava presente em 61,8% das amostras analisadas é um achado significativo, dado que nos rebanhos avaliados, esse agente não tinha sido previamente diagnosticado.

Construção de iniciadores e otimização de ensaios de PCR e de nested-PCR para a detecção específica de Tritrichomonas foetus / Primers design and optimization of PCR and nested-PCR assays for the specific detection of Tritrichomonas foetus

Tritrichomonas foetus é um protozoário patogênico responsável por doença venérea em bovinos conhecida por tricomonose genital bovina. A tricomonose bovina é uma doença venérea causada pelo protozoário cujo habitat natural é o trato genital. Os protocolos já desenvolvidos para o diagnóstico deste parasito por PCR, apesar de serem eficazes na identificação do DNA genômico alvo, promovem algumas amplificações inespecíficas ou são incapazes de distinguir T. foetus das outras espécies do gênero. O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de estabelecer e otimizar protocolos de ensaio de PCR e nested-PCR para o diagnóstico específico de T. foetus, empregando-se novos iniciadores, selecionados do alinhamento das seqüências dos genes 18S rRNA, 5,8S rRNA, 28S rRNA e dos espaços transcritos do rDNA (ITS1 e ITS2). Um par de iniciadores foi construído para amplificação gênero-específica de um fragmento de 648 pares de base e outros dois para a obtenção de produtos espécie- específicos de 343 e 429 pb. Nenhuma reação cruzada foi observada frente ao DNA genômico de Bos taurus ou de microrganismos responsáveis por infecções genitais. A sensibilidade dos ensaios de PCR e de nested-PCR apresentados neste estudo permitiu um limiar de detecção de até dois parasitos.

Tritrichomonas foetus is a pathogenic protozoan that causes a venereal disease in cattle known as bovine genital tricomonosis. In spite of the efficacy to recognize the target genomic DNA, the protocols so far developed for the diagnosis of this organism by PCR promote some inespecific amplifications or they are unable to discriminate T. foetus against other species within the genus. The objective of this study was to assess and optimize PCR and nested-PCR assays for the specific diagnosis of T. foetus, using novel primers selected from the alignment of sequences of the genes 18S rRNA, 5.8S rRNA, 28S rRNA and of the internal transcribed spacers of the rDNA (ITS1 and ITS2). A pair of primers was constructed for the genus-specific amplification of a 648 bp fragment and two others to amplify T. foetus species-specific fragments of 343 and 429 bp. No cross amplification was observed against Bos taurus genomic DNA neither against the DNA of usual bovine genital pathogens. Both, single and nested-PCR assays, presented analytical sensitivity to detect at least two T. foetus organisms.

Um novo meio de transporte e cultivo para Tritrichomonas foetus (Riedmuller, 1928) V. Lactopep como meio de cultivo / A new transfer and culture medium of Tritrichomonas foetus (Riedmuller, 1928) V. Lactopep as a culture medium

Para o diagnóstico da tricomonose bovina, o meio Lactopep foi testado para o transporte de amostras de lavado prepucial e de muco vaginal de bovinos infectados com Tritrichomonas foetus. A metodologia de colheita do material foi descrita por Lopes et al. (1994), utilizando o meio Guida-Kupferberg como testemunho. Os meios foram mantidos em temperatura ambiente e analisados após 24 horas. Pela análise de variação com delineamento inteiramente casualizado, avaliou-se o dia de máxima eficiência. Com Lactopep obteve-se a média de 9,8 dias e com Guida-Kupferberg, 9,2 dias, com material proveniente de machos naturalmente infectados; as médias das culturas para material proveniente de fêmeas foi 7,1 dias para o Lactope, e de 7,5 para o Guida-Kupferberg. A estatística demonstrou que os meios são eficientes para o transporte e cultivo de T. foetus, mas o meio Lactopep é de mais fácil preparo e de baixo custo. Na segunda etapa do experimento, adicionou-se ao Lactopep a fração de 10% de soro fetal bovino para manutenção de T. foetus por repiques sucessivos em laboratório, comparando-se ao de Hanks. Os dois meios permitem curva de crescimento em torno de sete dias, quando a fase de esgotamento chega aos valores mais baixos mas ainda viáveis. O Lactopep modificado para laboratório também mantém acentuada correlação negativa com o tempo de cultivo e pode ser indicado para a manutenção de T. foetus.

Lactopep medium efficacy for transport of Tritrichomonas foetus was checked in sample obtained from preputials washing of bulls and vaginal mucus of cows knowghy T. foetus positive, and compared to Guida-Kupferberg medium. Samples were obtained from bulls or cows with 0,85% saline solution and, half part of sample received three grams Lactopep; to the other half part, three grams of Guida-Kupferberg medi um were added. Both groups were kept at environmental temperature and daily examined under microscopy. The results were statistically analised by a variance analisis for casualised entirely delineation surveying the efficient maximum day. The Lactopep medium and Guida-Kupferber medium mean proceeded 9.8 day and 9.2 day respectively, with material from bulls, and 7.1 day and 7.5 day, respectively, with material from cows, and the conclusion is that both media are efficient for T. foetus maintenance but Lactopep medium has the advantage of the easy preparation and is produced at lower cost. In second stage to experiment to added in Lactopep medi um the fraction of 10% bovine se rum for maintainance to T. foetus by sucessive tollings in laboratory; the medium was compared with the Hanks medium. The results showed the both media allowed a line arround the seven days at the declive but further practicable. The Lactopep medium modificated for laboratory also conserve accentuated invertion correlation with the time cultivation, but it is indicat for maintaince of T. foetus in laboratory.